Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do Virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú

LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định
nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành. Tôi
xin chân thành cảm tạ:
 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi
những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường.
 TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.
 Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy sản
Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực
tập tốt nghiệp.
 Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa.
 Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong
quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
iii
TÓM TẮT
NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG
PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG
(WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)”.
Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005.
Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa
Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2).
Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV)
gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon). Thí nghiệm được bố trí bằng cách trộn chung
dịch chiết virus WSSV với các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ở các nồng độ khác
nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợp chất đối với virus WSSV. Sau khi sàng lọc,
tiến hành thử nghiệm hiệu quả tác dụng của các hợp chất này lên virus WSSV bằng cách
tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất vào cơ thể tôm thí nghiệm. Đánh giá tác
dụng của các hợp chất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệ sống của tôm thí nghiệm.
Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợp chất ký hiệu D
2
, B, M:
Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml):
Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus
hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus.
Hợp chất B và D
2
có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml), 5
(mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml).
iv
MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt vi
Mục lục v
Danh sách các hình viii
Danh sách các bảng và sơ đồ ix
PHẤN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích, yêu cầu 2
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới 3
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam 4
2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú 6
2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây
hội chứng đốm trắng trên tôm sú 7
2.4.1 Tác nhân gây bệnh 7
2.4.2 Khu vực phân bố 7
2.4.3 Ký chủ 8
2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền 8
2.4.5 Cơ chế xâm nhập 9
2.4.6 Bệnh lý 9
2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay 10
2.5.1 Một số phương pháp phổ biến 10
2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR 10
2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật 11
2.6.1 Alkaloid 11
v
2.6.2 Flavonoid 12
2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật
trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản 12
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu 15
3.2.1 Vật liệu sinh học 15
3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 15
3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm 15
3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 16
3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus 16
3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm 16
3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16
3.3.4 Phương pháp PCR 16
3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính 16
3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17
3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường 17
3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18
3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược
đối với virus gây hội chứng đốm trắng 18
3.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp
hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm 19
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20
4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược
đối với virus gây hội chứng đốm trắng 20
4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D
2
20
4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B 21
4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M 23
vi
4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV
và hợp chất D
2
, B ở các nồng độ khác nhau 23
4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D
2
27
4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B 29
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV
từ hỗn hợp
dịch chiết virus được ủ với hợp chất D
2
trong thời gian 2 giờ 20
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV
từ hỗn hợp
dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ 21
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV
từ hỗn hợp
dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ 22
H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D
2
trước thí nghiệm 28
H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D
2
sau thí nghiệm 28
H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B trước thí nghiệm 30
H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B sau thí nghiệm 30
viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng 3
Bảng 2.2 Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng bằng các phương pháp
khác nhau 10
Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 24
Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình
thí nghiệm 25
Bảng 4.3 Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA
của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26
SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo
dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 18
Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV
trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các
nồng độ khác nhau 19
ix

PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề.
Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc
biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao. Vì thế, sản lượng thủy sản không thể
đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày càng giảm do khai
thác quá mức. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc
biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là một nhu cầu cần
thiết.
Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gần đây,
đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển. Nghề nuôi tôm nước ta phát triển chủ yếu
mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến sự suy
thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh. Khoảng 20 năm gần
đây, dịch bệnh tôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm. Một trong
những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đó là bệnh đốm trắng ( White Spot
Desease ) do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thiệt hại có thể lên đến 100 %
quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh. Có nhiều phương pháp phòng trị
bệnh đốm trắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còn tồn tại nhiều
mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao.
Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rất
phong phú. Thảo dược từ xưa đã được ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu quả trong y học
và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử
nghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị bệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản là
hướng nghiên cứu mới và cần khai thác. Được sự đồng ý của Trung tâm Quốc gia Quan
trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE)
thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) và Bộ môn Công nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô hướng dẫn,
chúng tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm một số hợp chất chiết xuất từ
thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV)
trên tôm sú (Penaeus monodon)”
1
1.2 Mục đích yêu cầu
- Sàng lọc một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội
chứng đốm trắng (WSSV).
- Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất sàng lọc lên virus gây hội chứng đốm
trắng (WSSV) trong điều kiện thí nghiệm.
2

Xem chi tiết: Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do Virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú